研究与开发 RESEARCH
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?录



一、草酸降解酶与泌尿系结石?

二、草酸降解酶研究新进展?

三、康复得草酸降解酶临床数据?

四、尿草酸检测试剂盒?

五、相关发明专利及专利申请?

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一、草酸降解酶与泌尿系结石


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研发概述123?

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据统计, 全世界约有15%?的人口患有肾结石。 中国有近亿人一生中至少长一次结石。在美国,肾结石是七大住院治疗疾病之一,每年造成超过50亿美元的经济损失。 此外,肾结石的复发率高达50%以上,肾里反复长结石也是慢性肾病的发病原因之一,严重的还会发展成肾功能衰竭。

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目前,医学界对肾结石的治疗手段也是治标不治本。药物仅对6毫米以下的小结石起作用,大结石只能靠手术取出。无论是传统的开放性手术,还是现在流行的体外碎石、腔内处理和微创手术,都会对身体尤其是肾脏造成不同程度的损伤。更重要的是,因为没有有效的方法抑制结石复发,患者每隔几年就要经历一次手术排石的痛苦,肾脏反复受到创伤的后果就是肾功能的损伤甚至丧失。

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所以,治疗肾结石的难点不在于怎样取出结石,而在于如何有效的防止结石复发。

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草酸降解酶,是一种可以高效、专一和温和降解草酸的生物酶。食物中的草酸在胃中随着食物的消化被释放出来,经草酸降解酶降解,不被人体吸收,不会排泄到尿液中,防止尿液中的草酸盐结晶生成泌尿结石。

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二、草酸降解酶研究新进展

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研发概述123?

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近年来,?泌尿外科专家采用草酸降解酶降解人体内的草酸以预防治疗草酸钙结石症成为该领域的研究热点。
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研究表明,?通过固定化将草酸降解酶植入泌尿系统,?维持草酸钙结石部位草酸降解酶制剂的有效浓度,?可以有效降解尿液中草酸,?防止结石形成。但存在问题是固定化酶的制备是在体外进行的,?当固定化酶完全失活后必须重新植入以维持降解草酸能力,?而频繁对患者进行外科植入手术显然是不现实的。
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武汉康复得生物科技股份有限公司的科研人员从5000多种不同种属的植物与微生物中筛选出适应胃肠环境,在pH 2-8范围内具有高热稳定、高活力、高底物亲和力的草酸降解酶,能够快速分解草酸,使草酸钙结石肾结石因缺乏原料而无法形成。目前市场上尚无同类产品,属独家专家技术。

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结石在全球患病率高,其中80%是草酸钙结石,20%患者每1-2年复发一次。发病率还在逐年增长。但目前全球范围内还没有能很好预防草酸钙结石的食品和药物。这是因为生成草酸钙结石的重要原料—草酸,广泛存在于各种食物中,人们无法彻底杜绝草酸的摄入途径,因此,也无法阻止草酸钙的形成。

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武汉康复得生物科技股份有限公司经过十余年的研究,从5000多种不同种属的植物与微生物中成功筛选出一种适应胃肠环境,在pH2-8范围内具有高热稳定、高活力、高底物亲和力的草酸降解酶,能够快速分解草酸,使草酸钙结石因缺乏合成原料而无法形成。目前,市场上无同类产品,属国际首创。

参考文献:贺俊斌??林日辉??龙寒??梁宇薇??陈阳阳?;草酸降解酶预防治疗草酸钙结石症的研究进展【J】;广东医学;201507

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三、康复得草酸降解酶临床数据(此次临床结果论文发表于中国外科杂志(2018年10月刊))

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研发概述123


以下为论文内容:


口服草酸脱羧酶对降低肾结石患者尿草酸效果的多中心临床研究

作者:李国灏??董锐??周军??杨向利??曽令浩??占建文??郑涛??郭永连

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摘要

目的??探讨经口服含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料对降低肾结石患者尿草酸效果的临床观察。?方法??在7个医院招募草酸钙结石患者,将患者随机分为低剂量组与高剂量组,分别采用服用前与服用后自身对照的方法,评价补充低剂量或高剂量草酸脱羧酶对尿草酸的下降效果。临床效果观察期间,患者正常饮食但被建议应限制摄入高草酸食物,对照观察期为7天,在第6,7两天收集24h尿样检测尿草酸排泄量;测试观察期为7天,测试期间中餐与晚餐随餐口服含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料,于第6,7两天收集24h尿样检测尿草酸排泄量,比较服用前与服用后24h尿草酸排泄量的差异。?结果??结石患者服用草酸脱羧酶食用菌固体饮料后的24h尿草酸排泄量较服用前相比下降显著,幅度达23%(低剂量组)和33%(高剂量组)。?结论??口服含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料,可以显著降低草酸钙结石患者的尿草酸排泄,有助于预防草酸钙结石的复发。

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关键词:高草酸尿;草酸脱羧酶;草酸钙结石;尿草酸

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The efficacy of an orally administered oxalate decarboxylase to lower urinary oxalic acid in kidney stone patients: The first multicenter clinical study

Abstract

Objective?To evaluate the efficacy of an orally administered?edible?mushroom?powder?contained?oxalate decarboxylase (OxDc) to lower urinary oxalic acid in kidney stone patients.?Methods?Calcium oxalate stone formers were recruited from 7 hospitals, and then were allocated into two groups randomly. This observation period of this study was composed of two consecutive stages, control stage and intervention stage. During the 7-day control stage, patients were advised to keep their habitual dietary patterns but with less high-oxalate food, while in the 7-day intervention stage, patients in high OxDc?group or low OxDc?group took two or one pack of orally administered?edible?mushroom?powder with their lunch and supper, respectively. The 24-hour urinary oxalic acid and creatinine of the sixth and seventh day of each stage were collected and examined. Student t test was used to compare the changes of 24h urinary oxalic acid excretion between control stage and intervention stage.?Results?Compared to the 24-hour urinary oxalic acid excretion in control stage, the orally administered OxDc reduced 24-hour urinary oxalic acid excretion significantly both in high OxDc group (33%) and low OxDc group (23%).?Conclusion?In kidney stone patients, orally administered OxDc can significantly reduce urinary oxalate excretion. The orally administered OxDc may represent a novel approach for managing diet-induced secondary hyperoxaluria and urinary stone diseases.

Keywords:?hyperoxaluria, oxalate decarboxylase, Calcium oxalate stone, urinary oxalic acid

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泌尿系结石是一种全球性的泌尿外科的常见病,人的终生发病率高达13%[1]。据2012年美国国立卫生院(NIH)的统计数据,泌尿系结石在美国男女中的发病率分别为12%7%[2]。2016年,在全国范围进行的一项肾结石发病率横断面调查显示,我国泌尿系结石患病率为6.4%,经年龄与性别校正后患病率为5.8%(男性6.5%,女性5.1%),终生发病率为15.5%[3]。这一系列数据显示,泌尿系结石有着较高的发病率,其可能给全球健康医疗体系带来沉重负担,给病人造成巨大痛苦。

各种泌尿系结石中,含草酸钙成分结石占比高达86.4%[4]。高草酸尿症是一种可诱发草酸钙结石的严重的代谢疾病,随尿草酸水平增加肾结石形成的风险也增加[5]。尿液中草酸的来源有两个途径:体内代谢产生和食源性草酸摄入。某些遗传疾病可导致肝脏内源性草酸盐过量产生,称为原发性高草酸尿症;而食物中草酸摄入过量或胃肠道吸收异常,可导致继发性高草酸尿症。原发性高草酸尿症是罕见疾病,平均发病率为1.05/106?[6],绝大多数高草酸尿症患者为食源性草酸摄入或吸收异常所致。因此,低草酸低盐低蛋白饮食、多饮水或增加肠道内草酸盐降解,成为减少高草酸尿症发生乃至草酸钙结石形成的重要策略。但鉴于许多健康食品(如绿色蔬菜、坚果、水果等)中草酸普遍存在,且草酸在高盐高脂肪低钙饮食时吸收显著增加,要长期保持饮食中低草酸摄入极为困难[7]。因此,若能有药物手段有效减低尿草酸,将有助于减少肾结石及相关疾病的发生。

埃瓦尔巴利亚多2019年3 www.d14g.com 草酸盐在胃肠道中能在草酸降解酶的催化下降解食源性草酸,草酸降解酶包括草酸脱羧酶与草酸氧化酶。草酸脱羧酶是一种锰离子依赖型的生物酶,能专一性的将草酸底物催化为甲酸和二氧化碳,因此可在胃肠道中高效降解食物中的草酸及可溶性草酸盐,降低食源性草酸吸收从而减少尿草酸排泄。酶替代疗法是针对人体代谢功能异常所致疾病的有效治疗手段,口服或注射用的多种酶类制品如蔗糖酶片、乳糖酶片、注射用尿酸氧化酶等也应用于临床并取得不错的效果。本多中心随机对照试验拟探讨一种含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料对降低肾结石患者尿草酸的能力,评估其是否有望作为高草酸尿症及肾结石患者的辅助治疗或预防性手段。

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资料与方法

1.含草酸脱羧酶食用菌固体饮料:本研究中使用的测试品为含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料,该产品由武汉康复得生物科技股份有限公司研发并提供。本测试品的规格为6g/袋,每袋饮料中含有600单位(U)的草酸脱羧酶。一个单位的酶活性定义为在37pH3.0条件下在1min内将1μmol草酸盐转化为甲酸盐所需的酶量。

2.研究中心及参与者招募:本研究为多中心研究,在武汉市中心医院、武汉市第四医院、湖北省中山医院、武汉科技大学附属天佑医院、武汉市汉阳医院、红安县人民医院、麻城市人民医院等7个中心招募肾结石患者,本临床研究预计在各中心共招募100名肾结石患者。研究方案通过各研究中心的伦理委员会审查及批准,并获取每名患者的知情同意书?;颊吣扇氡曜嘉夯颊呓崾饕煞志崾煞址治鋈啡衔菟岣平崾?、BMI 18-30 kg/m2、24h尿钙排泄量<300mg,24h尿柠檬酸盐排泄正常。

3.研究方法:本研究采用服用前(对照观察期)与服用后(测试观察期)自身效果比较的方案,评价含草酸脱羧酶食用菌固体饮料的降尿草酸效果。将招募患者随机分为低剂量组和高剂量组。对照观察期(7天)时,所有患者正常饮食但被建议限制摄入高草酸食物,在第6、7天分别收集24h尿液样品,检测尿草酸排泄量;测试观察期(7天)时,患者正常饮食,但在中餐和晚餐时随餐口服含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料(低剂量组1/餐,高剂量组2/餐),在第6、7天分别收集24h尿液样品,检测尿草酸排泄量。本研究中24h尿草酸采用万通离子色谱仪测定,肌酐指标采用肌酐(酶法)测定试剂盒测定。比较服用前与服用后尿草酸排泄量及肌酐量的差异。

4.统计学方法:应用SPSS 21. 0软件进行数据处理,计量资料以均数±标准差( x±s)?表示,服用产品前后尿草酸值及肌酐值比较采用t检验,P0. 05为差异有统计学意义。

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研究结果:

1.?受试者情况:本研究通过7个研究中心纳入受试者共100例,其中由于各种原因未能按规定服用产品或收集424h尿液导致脱落的患者共25例,参与并完成本临床研究的共75例。其中低剂量组43例患者完成试验,高剂量组32例完成试验。男性47例,女性28例;年龄在25岁与76岁之间(平均年龄53.5岁)。详细的患者基本信息见表1。


1.?患者基本信息:

指标

低剂量组

高剂量组

人数

43

32

平均年龄(岁)

53.2±15.3

54.19±17.2

BMIkg/m2

23.57±3.22

25.29±3.08

性别(男/女)

28/15

19/13

草酸(mg/d

55.13±22.23

66.03±17.67

肌酐(mg/d

1179±359

1234±470

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2.尿草酸降低效果:两个剂量组的患者在口服含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料前(对照观察期)、后(测试观察期),尿液中相关指标(草酸与肌酐)测定值的比较见表2与表3。结果显示,口服草酸脱羧酶食用菌固体饮料600U/餐可使24h尿草酸总量下降12.78mg,下降幅度达23%;服用1200U/餐可使24h尿草酸总量下降20.7mg,幅度达33%。两个剂量组的24h尿草酸下降幅度均具有统计学意义。两组患者口服食用菌固体饮料前后24h尿肌酐量无显著性差异。


此外,图1与图2分别展示了低剂量组和高剂量组患者的24h尿草酸降低情况,结果显示,服用含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料后,绝大多数患者的尿草酸排泄量是下降的,部分患者下降非常显著,甚至可降至正常人尿草酸的排泄范围(<42mg/d)。然而,个别患者尿草酸下降并不显著,甚至极少数患者尿草酸有上升趋势,具体原因我们会在后续研究中深入观察。

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2.?口服草酸脱羧酶(600U/餐)尿草酸及肌酐的检测值比较


项目

服用前

服用后

T

P

尿草酸(mg/d

55.13±22.23

42.35±22.12

2.672

0.009

尿肌酐(mg/d

1179±359

1253±432

0.8639

0.390

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3.?口服草酸脱羧酶(1200U/餐)尿草酸及肌酐的检测值比较

项目

服用前

服用后

T

P

尿草酸(mg/d

66.03±17.67

45.34±15.92

4.921

<0.001

尿肌酐(mg/d

1234±470

1187±407

0.4276

0.670

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口服草酸降解酶对降低肾结石患者尿草酸水平临床观察? ? ? ? ? ? ? ? ? ?口服草酸降解酶对降低肾结石患者尿草酸水平临床观察

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1.?低剂量组患者尿草酸下降图 ?????????????????图2.?高剂量组患者尿草酸下降图

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讨论

食源性草酸吸收代谢异常导致的尿草酸偏高,是大多数泌尿系草酸钙结石患者发病以及复发的主要因素。Borghi等人对120例草酸钙结石患者进行了长达5年的跟踪研究,探讨低钙饮食与正常钙饮食对结石的发病率的影响,结果显示正常钙饮食组的尿草酸水平较低钙饮食组下降7.2mg/d,而其结石复发率可显著降至低钙饮食组的50%[8]。限制食物中草酸摄入是各大权威尿石防治指南中预防结石的推荐建议,然而要严格限制草酸摄入非常困难,且可能减少健康食物摄入或严重影响患者生活质量。而由于食物中草酸需要在胃肠道进行消化吸收或代谢降解,因此通过口服草酸脱羧酶在胃肠道中催化分解草酸,从而降解食物中的草酸达到限制草酸吸收的目的,是一种创新性的降低食源性草酸吸收的策略。Grujic等人使用AGT1基因敲除小鼠为模型,通过口服200mg的交联草酸脱羧酶晶体,使尿草酸及粪草酸分别降低了44%72%,有效地防止了小鼠肾钙质沉着症及尿石症的发生[9]。Cowley等人利用口服草酸脱羧酶制剂(Oxazyme)连续饲喂大鼠及狗14 d,评估口服草酸脱羧酶作用于动物消化道时的可能毒性,表明对大鼠或狗饲喂草酸脱羧酶制剂均未见明显不良反应[10]。这些研究显示口服草酸降解酶制品,是较为安全有效的。但上述研究均未进行人体临床试验,因此仍旧不能确定这一降低尿草酸策略是否能在人体取得同样的效果。此外,上述研究所采用的草酸降解酶制品并未考虑口感、受试者接受度等因素,难以确保受试者的依从性。

本临床研究评估了一种含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料对尿草酸降低的影响。研究结果显示,随餐口服600U草酸脱羧酶的食用菌固体饮料,可降低尿草酸幅度达23%13mg/d);而随餐口服1200U草酸脱羧酶的食用菌固体饮料,尿草酸下降幅度可达33%21mg/d),降低值远高于Borghi等人研究中两种饮食方式的7.2mg/d的尿草酸水平差异。因此,我们研究显示,服用含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料,预期可显著降低尿草酸水平,并明显降低草酸钙结石患者结石复发的风险。且高剂量组尿草酸下降幅度明显较高,显示该食用菌固体饮料的降尿草酸作用可能具有剂量依赖性。此外,本研究显示受试者对食用菌固体饮料具有较高的接受度,且试验中未观测到任何不良反应,且患者服用产品前后尿肌酐水平无显著差异。本研究结果与Langman等人的一项双盲、安慰剂对照的随机对照交叉试验结果类似,该研究显示一种口服草酸降解酶制剂(ALLN-177)在正常志愿者中可安全有效降低尿草酸含量[11]。

本临床试验有一系列优势:首先,相对于Langman等人研究[11],本研究样本量较大,结论更具有说服力;其次,本研究为多中心研究,设计合理,患者随机分配为高低剂量组,且为患者服用前后自身对照,可减少多方面的研究偏倚;再次,本研究招募的受试者为草酸钙结石患者,而非健康受试者,更好的针对临床需要。尽管如此,本研究也存在一些不足之处,例如并未设计安慰剂(空白对照)、随访期较短。后续我们将继续扩大样本、增加随访期,对结石患者进行长期的跟踪观察,以对口服草酸降解酶对防治草酸钙结石复发的的效果进行更加深入的研究。

总之,本研究显示随餐口服草酸脱羧酶制剂,可有效降低草酸钙结石患者尿草酸含量,有望成为高草酸尿症及草酸钙结石患者的有效防治手段。

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致谢:

感谢武汉康复得生物科技股份有限公司提供本次临床效果观察研究的含草酸脱羧酶的食用菌固体饮料。

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参考文献:

[1]?Brzica H, Breljak D, Burckhardt BC, et al. Oxalate: from the environment to kidney stones.[J]. Archives of Industrial Hygiene & Toxicology, 2013, 64(4):609-630.

[2]?Pearle MS, Calhoun EA, Curhan GC. Urologic diseases in America project: urolithiasis[J]. Journal of Urology, 2005, 173(3):848.

[3]?Zeng G, Mai Z, Xia S, et al. Prevalence of kidney stones in China: an ultrasonography based cross﹕ectional study[J]. BJU?International, 2017, 120(1):109.

[4]?那彦群,叶章群,孙颖浩,孙光.?中国泌尿外科疾病诊断治疗指南手册:2014[M].?人民卫生出版社, 2014.

[5] Curhan GC, Willett WC, Speizer FE, et al. Twenty-four–hour urine chemistries and the risk of kidney stones among women and men[J]. Kidney International, 2001, 59(6):2290.

[6] Cochat P, Deloraine A, Rotily M, et al. Epidemiology of primary hyperoxaluria type 1[J]. Nephrology Dialysis Transplantation, 1995, 10(supp8):3-7.

[7] Schwen ZR, Riley JM, Shilo Y, et al. Dietary management of idiopathic hyperoxaluria and the influence of patient characteristics and compliance[J]. Urology, 2013, 82(6):1220-5.

[8] Borghi L, Schianchi T, Meschi T, et al. Comparison of two diets for the prevention of recurrent stones in idiopathic hypercalciuria[J]. N Engl J Med. 2002,?346(2):77-84.

[9] Grujic D, Salido EB, Langman C, et al. Hyperoxaluria is reduced and nephrocalcinosis prevented with an oxalate-degrading enzyme in mice with hyperoxaluria.[J]. American Journal of Nephrology, 2016, 29(2):86-93.

[10] Cowley AB, Poage DW, Dean RR, et al. 14-day repeat-dose oral toxicity evaluation of oxazyme in rats and dogs[J]. International Journal of Toxicology, 2010, 29(1):20-31.

[11] Langman CB, Grujic D, Pease RM, et al. A Double-Blind, Placebo Controlled, Randomized Phase 1 Cross-Over Study with ALLN-177, an Orally Administered Oxalate Degrading Enzyme[J]. American Journal of Nephrology, 2016, 44(2):150-158.

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作者:1、郭永连??武汉市中心医院泌尿外科

??????2、李国灏??武汉市中心医院泌尿外科

??????3、????武汉市汉阳医院泌尿外科

??????4、????湖北省第三人民医院泌尿外科

??????5、杨向利??武汉科技大学附属天佑医院泌尿外科

??????6、曽令浩??麻城市人民医院泌尿外科

??????7、占建文??红安县人民医院泌尿外科

??????8、????武汉市第四医院泌尿外科

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四、尿草酸检测试剂盒

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研发概述123?

尿草酸检测试剂盒由康复得自主研发,国家专利(酶法)尿液检测。相关产品及技术已获得发明专利授权:《用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法》,专利号ZL 2014 1 0719849.4。2017年8月份获得专利授权,9月份通过伦理委员会审查批准。通过与美国Trinity Biotech和德国ROCHE旗下R-Biopharm检测精准度对比,偏差值不超过±5%。

康复得尿液检测服务主要测定尿液中的尿酸、草酸、枸橼酸、Ca、Mg、磷、24h尿总量、尿肌酐以及pH值等共9项结石风险因子,全面分析患者结石成因、评估结石复发危险程度。

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五、相关发明专利及专利申请

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研发概述123

研发概述123

研发概述123

研发概述123







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